直接 ELISA 操作步驟

　　常規(guī)程序

　　包被抗原

　　1. 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后進(jìn)行系列稀釋。

　　樣品純度較高時(shí)通常在酶標(biāo)板上稀釋到不少于 2μg/ml。

　　不一定用純化的溶液，不過，一般在試驗(yàn)樣品中目的蛋白(抗原)含量需大于 3%。

　　抗原的蛋白濃度在酶標(biāo)板上應(yīng)該不高于 20μg/ml，此時(shí)已經(jīng)足夠中和酶標(biāo)板上的位點(diǎn)了。

　　確保抗原的濃度在抗體可以檢測到的范圍內(nèi)。

　　2.在酶標(biāo)板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時(shí)，或者 4°C 過夜。包被的孵育時(shí)間需要優(yōu)化。

　　3.倒掉孵育溶液，用PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標(biāo)板除去殘留液體。 封閉

　　4. 用 200μl 含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標(biāo)板上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。或者用其他封閉劑如 BlockACE、BSA (牛血清蛋白)代替。

　　5.用封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫至少孵育 2 小時(shí)，或者 4°C 過夜。 6.用 PBS 洗板 2 次。

　　加抗體孵育

　　7.加入 100 μl 抗體，稀釋到最佳濃度(參照說明書)，使用前用封閉液現(xiàn)配。

　　8. 用封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫孵育 2 小時(shí)，該孵育時(shí)間需要進(jìn)行優(yōu)化。盡管 2 小時(shí)的孵育通常可以獲得足夠強(qiáng)的信號(hào)，但如果獲得 的信號(hào)較弱時(shí)，通過 4°C 孵育過夜通常可以獲得較強(qiáng)信號(hào)。

　　9.用 PBS 洗板 4 次。

　　檢測

　　10.用多通道吸液器向每孔加入 100μl(或 50μl)底物。

　　11.顯示出足夠深的顏色之后，再向每孔加終止液 100μl(如果必須)。 12.用酶標(biāo)儀讀每個(gè)孔的吸光度值(光密度)。

　　注意：一些酶作用物是有害的 ( 致癌物 )，因此必須小心操作并佩戴手套。

　　數(shù)據(jù)分析

　　根據(jù)連續(xù)稀釋的數(shù)據(jù)制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，x 軸為濃度(對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)，y 軸為吸光度值(線性)。將樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 濃度。

　　3.夾心 ELISA

　　夾心 ELISA 用兩種抗體協(xié)同測定抗原的含量(例如：捕獲抗體和檢測抗體)。抗原必須包含至少 2 個(gè)能被抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)才 能被檢測，因?yàn)橹辽儆?2 個(gè)抗體參與到這個(gè)試驗(yàn)中。

　　在夾心 ELISA 中，單克隆抗體和多克隆抗體都可以被用作捕獲和檢測抗體。單抗識(shí)別單一的抗原表位，可以區(qū)別抗原的微小差別 使抗原得到更精確地檢測和定量。多克隆抗體通常被用作捕獲抗體 , 以捕獲盡可能多的抗原。

　　夾心 ELISA 的優(yōu)勢是樣品在分析前不需要純化 , 檢測靈敏度高(靈敏度是直接法或間接法的 2-5 倍)。 注意事項(xiàng)：

　　夾心 ELISA 的步驟很難優(yōu)化，試驗(yàn)中應(yīng)使用測試過的配對(duì)抗體。這樣可以確保在不干擾其他抗體結(jié)合的情況下，檢測目標(biāo)蛋白上 相應(yīng)的不同抗原表位。因此對(duì)于沒有做過特定測試試驗(yàn)的抗體，我們不能確保我們的抗體可以用于夾心 ELISA。請(qǐng)參閱抗體說明 書有關(guān)抗體測定應(yīng)用的信息。

　　常規(guī)步驟：

　　包被捕獲抗體

　　1. 用碳酸鹽 / 重碳酸鹽緩沖液 (pH7.4) 稀釋捕獲抗體至濃度 1-10μg/ml，包被酶標(biāo)板。

　　如果使用了沒有純化的抗體(例如 : 腹水或抗血清)，可能需要通過提高樣品蛋白濃度(試一下 10μg/ml)，

　　來補(bǔ)償特定抗體數(shù)量較低的問題。

　　2. 用封口膜覆蓋酶標(biāo)板，于 4°C 孵育過夜。

　　3. 倒掉包被液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標(biāo)板除去殘留液體。 封閉和加樣品

　　4. 封閉包被后孔內(nèi)殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn) , 每孔加 200μl，含 5% 脫脂奶粉的 PBS 封閉液。

　　5. 用封口膜覆蓋酶標(biāo)板，室溫孵育至少 1-2 小時(shí)或者如果方便的話，4°C 孵育過夜。

　　6. 每孔加 100μl 適當(dāng)稀釋的樣品。在精確定量測定時(shí)，通常將未知濃度樣品與陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，每塊板都要帶標(biāo)準(zhǔn)(做 平行或者三 份)和空白對(duì)照以保證精確性。37°C 孵育 90 分鐘。

　　對(duì)于定量檢測，標(biāo)準(zhǔn)品的使用濃度應(yīng)覆蓋抗體結(jié)合的大部分動(dòng)態(tài)檢測范圍。您可能需要優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品的濃度使用范圍， 以確保得到一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了精確定量，樣品和標(biāo)準(zhǔn)通常做 2 份或 3 份。

　　7. 倒掉樣品 , 每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。 用檢測抗體和二抗先后進(jìn)行孵育

　　8. 每孔加入 100μl 稀釋好的檢測抗體。

　　9. 用封口膜覆蓋酶標(biāo)板，室溫孵育 2 小時(shí)。

　　10. 用 PBS 洗板 4 次。

　　11. 加入 100μl 標(biāo)記二抗，使用前用封閉液快速稀釋至最佳濃度(根據(jù)說明書)。

　　12. 用封口膜覆蓋酶標(biāo)板，室溫孵育 1-2 小時(shí)。

　　13. 用 PBS 洗板 4 次。

　　檢測

　　雖然許多種類的酶都可以用來檢測，但辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 實(shí)驗(yàn)中是被廣泛應(yīng)用的兩種酶。我們必 須要考慮到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性(例如肺泡細(xì)胞中高含量的 AP, 紅血球中高含量的過氧化物酶)，這可能導(dǎo)致 不精確的結(jié)果。如果有必要的話，用左旋咪唑(針對(duì) AP)或含 0.3% 雙氧水溶液的甲醇(針對(duì)過氧化物酶)進(jìn)行一個(gè)附加的封閉 處理。

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